Xavier Robert(1), Nushin Aghajari(1), Birte Svensson(2), Hugues Driguez(3) and Richard Haser(1)
(1)Institut de Biologie et Chimie des Protéines, Laboratoire de Bio-Cristallographie, UPR 412 CNRS, 7 passage du Vercors, 69367 Lyon cedex 07, France
(2)Carlsberg Laboratory, Department of Chemistry, Gamle Carlsbergvej 10, 2500 Valby, Denmark
(3)CERMAV – CNRS, BP 53, 38041 Grenoble cedex 9, France

Les alpha-amylases sont des endoglucanases très largement répandues chez les animaux, les plantes, les bactéries et les champignons. Elles catalysent la dépolymérisation de l’amidon et des poly- ou oligosaccharides apparentés, par hydrolyse sélective des liaisons alpha-1,4 glycosidiques. Le site actif de ces enzymes est constitué par un ensemble de sous-sites, chacun interagissant avec un résidu glycosyl du substrat. Les structures tridimensionnelles de plusieurs alpha-amylases ont été établies par notre groupe, grâce à des études par cristallographie de diffraction des rayons-X à haute résolution : alpha-amylases de pancréas de porc (1,2), de graines d’orge (3,7) et une amylase psychrophile présente dans une bactérie provenant de l’Antarctique (4).

Les graines d’orge en germination contiennent deux isoenzymes majeures d’alpha-amylases : AMY1 et AMY2, impliquées dans la dégradation de l’amidon dans le but de fournir de l’énergie utilisée par l’embryon de plante pour sa croissance.

La structure tridimensionnelle d’AMY2 a été résolue, à la fois dans son état natif (3), mais aussi complexée avec l’acarbose (5), un pseudo-tetrasaccharide, puissant inhibiteur de plusieurs glycosidases. En outre, il a été montré qu’une protéine endogène bifonctionnelle (BASI, 19kDa) présente dans les graines d’orge inhibait à la fois une serine protéase de la famille des subtilisines, et AMY2, mais pas AMY1. Le complexe AMY2-BASI a été cristallisé et sa structure a été résolue à une résolution de 1.9 Å (6). L’association protéine / protéine implique une très grande surface de contact (2350 Å2) qui a été décrite en détail. L’interface enzyme / inhibiteur est caractérisée par un nouveau type de site chélateur du calcium, ce dernier étant entièrement solvaté et interagissant avec les résidus catalytiques essentiels via ses ligands H2O. Ces résultats contribuent à une meilleure connaissance, au niveau moléculaire, des mécanismes par lesquels AMY2 est inhibé ou réalise l’hydrolyse de l’amidon et des polysaccharides.

Dans ce même but, la connaissance de la structure 3D d’AMY1 est nécessaire afin de comprendre les spécificités (par exemple, la non inhibition d’AMY1 par BASI) mais aussi les différences très significatives en termes de propriétés physico-chimiques des deux isoenzymes.

AMY1 a été surproduite dans P. pastoris et a pu être récemment cristallisée, de même qu’une forme tronquée d’AMY1 (délétion de 11 résidus C-terminaux) (7). La détermination de la structure des ces deux enzymes recombinantes, à haute résolution, est en cours (7). Ici, nous montrons les premiers résultats de cette étude structurale comparative au niveau atomique, orientée vers l’élucidation de la spécificité et de l’activité des isoenzymes en présence de leurs inhibiteurs et de leurs substrats polysaccharidiques. En particulier, trois aspects seront détaillés : les sites de fixation des ions calcium structuraux, l’aire de reconnaissance de BASI, et le site actif.

De plus, par la connaissance de la structure d’AMY1, une étude par modélisation nous a permis d’orienter la synthèse d’un analogue de substrat photoactivable (Driguez et al., résultats non publiés) ouvrant la voie, par la suite, à des études structurales des étapes intermédiaires le long du chemin réactionnel caractéristique de ces glycosyl hydrolases.

Références :
1.  Qian, M., Haser, R. & Payan, F. (1993) J. Mol. Biol. 231, 785-799.
2.  Qian, M., Haser, R. & Payan, F. (1995) Protein Sci. 4, 747-755.
3.  Kadziola, A., Abe, J., Svensson, B. & Haser, R. (1994) J. Mol. Biol. 239, 104-121.
4.  Aghajari, N., Feller, G., Gerday, C. & Haser, R. (1998) Protein Sci. 7, 564-572.
5.  Kadziola, A., Søgaard, M., Svensson, B. & Haser, R. (1998) J. Mol. Biol. 278, 205-217.
6.  Vallée, F., Kadziola, A., Juy, M., Bourne, Y., Rodenburg, K., Svensson, B.& Haser, R.
     (1998) Structure 6, 649-659.
7.  Aghajari et al. En préparation.